Kromatografi cair mangrupikeun metodeu utama pikeun nguji eusi unggal komponén sareng najis dina bahan baku, perantara, persiapan sareng bahan bungkusan, tapi seueur bahan henteu gaduh metode standar pikeun ngandelkeun, janten teu tiasa dihindari pikeun ngembangkeun metode anyar. Dina pamekaran metode fase cair, kolom kromatografi mangrupikeun inti kromatografi cair, janten penting pisan pikeun milih kolom kromatografi anu cocog. Dina tulisan ieu, panulis bakal ngajelaskeun kumaha carana milih kolom kromatografi cair tina tilu aspék: ideu umum, pertimbangan sareng ruang lingkup aplikasi.
A. Sacara umum gagasan pikeun milih kolom kromatografi cair
1. Evaluate sipat fisik jeung kimia analyte nu: kayaning struktur kimiawi, kaleyuran, stabilitas (kayaning naha éta gampang jadi dioksidasi / ngurangan / dihidrolisis), kaasaman jeung alkalinity, jsb, utamana struktur kimia nyaéta konci. faktor dina nangtukeun sipat, kayaning grup conjugated boga nyerep ultraviolét kuat tur fluoresensi kuat;
2. Nangtukeun tujuan analisis: naha separation tinggi, efisiensi kolom tinggi, waktos analisis pondok, sensitipitas tinggi, résistansi tekanan tinggi, hirup kolom panjang, béaya rendah, jsb anu diperlukeun;
- Pilih kolom kromatografi anu cocog: ngartos komposisi, sipat fisik sareng kimia tina pangisi kromatografi, sapertos ukuran partikel, ukuran pori, kasabaran suhu, kasabaran pH, adsorpsi analit, jsb.
- Pertimbangan pikeun milih kolom kromatografi cair
Bab ieu bakal ngabahas faktor-faktor anu kedah dipertimbangkeun nalika milih kolom kromatografi tina sudut pandang sipat fisik sareng kimia kolom kromatografi sorangan. 2.1 Filler matrix
2.1.1 Matriks silika gél Matriks pangeusi kalolobaan kolom kromatografi cair nyaéta silika gél. Jinis pangisi ieu ngagaduhan kamurnian anu luhur, béaya rendah, kakuatan mékanis anu luhur, sareng gampang pikeun ngarobih grup (sapertos beungkeutan fenil, beungkeutan amino, beungkeutan siano, jsb.), tapi nilai pH sareng kisaran suhu anu ditoleransina terbatas: Kisaran pH kalolobaan pangisi matriks silika gél nyaéta 2 dugi ka 8, tapi kisaran pH tina fase kabeungkeut silika gél anu dirobih khusus tiasa lega 1.5 dugi ka 10, sareng aya ogé fase kabeungkeut silika gél anu dirobih anu stabil dina pH rendah, kayaning Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, nu stabil dina pH 1 nepi ka 8; wates suhu luhur matriks gél silika biasana 60 ℃, sarta sababaraha kolom kromatografi bisa tolerate suhu 40 ℃ dina pH luhur.
2.1.2 Matriks polimér Pangeusi polimér lolobana polystyrene-divinylbenzene atawa polymethacrylate. Kaunggulan maranéhanana nyaéta yén maranéhna bisa tolerate rentang pH lega - aranjeunna bisa dipaké dina rentang 1 nepi ka 14, sarta aranjeunna leuwih tahan ka suhu luhur (bisa ngahontal luhureun 80 °C). Dibandingkeun sareng pangisi C18 berbasis silika, jinis pangisi ieu gaduh hidrofobik anu langkung kuat, sareng polimér macroporous efektif pisan pikeun misahkeun conto sapertos protéin. Karugianna nyaéta efisiensi kolom langkung handap sareng kakuatan mékanis langkung lemah tibatan pangisi dumasar silika. 2.2 Wangun partikel
Kalolobaan pangeusi HPLC modern nyaéta partikel buleud, tapi kadang partikel henteu teratur. partikel buleud bisa nyadiakeun tekanan kolom handap, efisiensi kolom luhur, stabilitas jeung umur panjang; nalika ngagunakeun fase sélulér viskositas tinggi (sapertos asam fosfat) atanapi nalika solusi sampelna kentel, partikel anu henteu teratur ngagaduhan aréa permukaan spésifik anu langkung ageung, anu langkung kondusif pikeun tindakan pinuh ku dua fase, sareng hargana kawilang rendah. 2.3 Ukuran partikel
Ukuran partikel anu langkung alit, langkung luhur efisiensi kolom sareng langkung luhur pamisahan, tapi langkung parah résistansi tekanan tinggi. Kolom anu paling sering dianggo nyaéta kolom ukuran partikel 5 μm; lamun sarat separation nyaeta luhur, a 1.5-3 μm filler bisa dipilih, nu kondusif pikeun ngarengsekeun masalah separation sababaraha matrix kompléks jeung sampel multi-komponén. UPLC tiasa nganggo pangisi 1,5 μm; Pangisi ukuran partikel 10 μm atanapi langkung ageung sering dianggo pikeun kolom semi-preparative atanapi preparative. 2.4 Kandungan karbon
Eusi karbon nujul kana proporsi fase kabeungkeut dina beungeut gél silika, nu patali jeung aréa permukaan husus jeung sinyalna fase kabeungkeut. Eusi karbon tinggi nyadiakeun kapasitas kolom tinggi na resolusi luhur, sarta mindeng dipaké pikeun sampel kompléks merlukeun separation tinggi, tapi alatan waktu interaksi panjang antara dua fase, waktu analisis panjang; Kolom kromatografi eusi karbon rendah gaduh waktos analisis anu langkung pondok sareng tiasa nunjukkeun selektipitas anu béda, sareng sering dianggo pikeun conto saderhana anu peryogi analisa gancang sareng conto anu peryogi kaayaan fase cai anu luhur. Sacara umum, eusi karbon C18 berkisar antara 7% dugi ka 19%. 2.5 Ukuran pori jeung aréa permukaan husus
Média adsorpsi HPLC nyaéta partikel porous, sarta lolobana interaksi lumangsung dina liang. Ku alatan éta, molekul kudu asup kana liang pikeun adsorbed sarta dipisahkeun.
Ukuran pori sareng luas permukaan spésifik mangrupikeun dua konsép pelengkap. Ukuran pori leutik hartina aréa permukaan husus badag, sarta sabalikna. Wewengkon permukaan spésifik anu ageung tiasa ningkatkeun interaksi antara molekul sampel sareng fase kabeungkeut, ningkatkeun ingetan, ningkatkeun beban sampel sareng kapasitas kolom, sareng pamisahan komponén kompléks. Pangisi pinuh porous kalebet jinis pangisi ieu. Pikeun anu ngagaduhan syarat pamisahan anu luhur, disarankeun pikeun milih pangisi kalayan aréa permukaan spésifik anu ageung; aréa permukaan husus leutik bisa ngurangan tekanan deui, ngaronjatkeun efisiensi kolom, sarta ngurangan waktu kasatimbangan, nu cocog pikeun analisis gradién. Pangisi cangkang inti kalebet jinis pangisi ieu. Dina premis pikeun mastikeun pamisahan, disarankeun pikeun milih pangisi kalayan aréa permukaan khusus anu leutik pikeun anu ngagaduhan syarat efisiensi analisa anu luhur. 2.6 Volume pori jeung kakuatan mékanis
Volume pori, ogé katelah "volume pori", nujul kana ukuran volume void per unit partikel. Éta ogé tiasa ngagambarkeun kakuatan mékanis tina pangisi. Kakuatan mékanis pengisi kalayan volume pori ageung rada lemah tibatan pangisi kalayan volume pori leutik. Pangeusi kalayan volume pori kirang ti atanapi sami sareng 1.5 mL / g biasana dianggo pikeun pamisahan HPLC, sedengkeun pangisi kalayan volume pori langkung ageung tibatan 1.5 mL / g utamina dianggo pikeun kromatografi pangaluaran molekular sareng kromatografi tekanan rendah. 2.7 Laju capping
Capping tiasa ngirangan puncak tailing disababkeun ku interaksi antara sanyawa sareng gugus silanol anu kakeunaan (sapertos beungkeutan ionik antara sanyawa basa sareng gugus silanol, gaya van der Waals sareng beungkeut hidrogén antara sanyawa asam sareng gugus silanol), ku kituna ningkatkeun efisiensi kolom sareng bentuk puncak. . Fase kabeungkeut anu teu ditutupan bakal ngahasilkeun selektivitas anu béda-béda dibandingkeun sareng fase kabeungkeut anu ditutup, khususna pikeun conto polar.
- Lingkup aplikasi kolom kromatografi cair béda
Bab ieu bakal ngajelaskeun wengkuan aplikasi tina tipena béda kolom kromatografi cair ngaliwatan sababaraha kasus.
3.1 Kolom kromatografi C18 fase balik
Kolom C18 nyaéta kolom fase tibalik anu paling sering dianggo, anu tiasa nyumponan eusi sareng tés najis kalolobaan zat organik, sareng tiasa dianggo pikeun zat sedeng-polar, lemah polar sareng non-polar. Jinis sareng spésifikasi kolom kromatografi C18 kedah dipilih dumasar kana syarat pamisahan khusus. Contona, pikeun zat kalawan syarat separation tinggi, 5 μm * 4,6 mm * 250 mm spésifikasi mindeng dipaké; pikeun zat kalawan matriks separation kompléks jeung polaritasna sarupa, 4 μm * 4,6 mm * 250 mm spésifikasi atawa ukuran partikel leutik bisa dipaké. Salaku conto, panulis ngagunakeun kolom 3 μm * 4,6 mm * 250 mm pikeun ngadeteksi dua pangotor genotoxic dina API celecoxib. Separation tina dua zat bisa ngahontal 2,9, nu alus teuing. Salaku tambahan, dina premis pikeun mastikeun pamisahan, upami analisa gancang diperyogikeun, sering dipilih kolom pondok 10 mm atanapi 15 mm. Salaku conto, nalika panulis nganggo LC-MS / MS pikeun ngadeteksi najis genotoksik dina API fosfat piperaquine, kolom 3 μm * 2,1 mm * 100 mm dianggo. Separation antara najis jeung komponén utama éta 2.0, sarta deteksi sampel bisa réngsé dina 5 menit. 3.2 Kolom fenil fase balik
Kolom fenil ogé mangrupikeun jinis kolom fase sabalikna. Jenis kolom ieu gaduh selektivitas anu kuat pikeun sanyawa aromatik. Upami réspon sanyawa aromatik anu diukur ku kolom C18 biasa lemah, anjeun tiasa mertimbangkeun ngagentos kolom fenil. Salaku conto, nalika kuring ngadamel API celecoxib, réspon komponén utama diukur ku kolom phenyl tina produsén anu sami sareng spésifikasi anu sami (sadayana 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) sakitar 7 kali tina kolom C18. 3.3 Kolom fase normal
Salaku suplement éféktif pikeun kolom fase tibalik, kolom fase normal cocog pikeun sanyawa kacida polar. Lamun puncak masih pisan gancang nalika eluting kalawan leuwih ti 90% fase cai dina kolom fase tibalik, komo deukeut jeung tumpang tindih jeung puncak pangleyur, Anjeun bisa mertimbangkeun ngaganti kolom fase normal. Jenis kolom ieu kalebet kolom hilik, kolom amino, kolom siano, jsb.
3.3.1 Kolom hilik Kolom hilik biasana nyelapkeun gugus hidrofilik dina ranté alkil anu kabeungkeut pikeun ningkatkeun réspon kana zat polar. Jenis kolom ieu cocog pikeun analisa zat gula. Panulis ngagunakeun jinis kolom ieu nalika ngalakukeun eusi sareng zat anu aya hubunganana xilosa sareng turunanna. Isomér tina turunan xylose ogé bisa dipisahkeun ogé;
3.3.2 Kolom amino sareng kolom siano Kolom amino sareng kolom siano nujul kana bubuka modifikasi amino sareng siano dina tungtung ranté alkil anu kabeungkeut, masing-masing, pikeun ningkatkeun selektivitas zat khusus: contona, kolom amino mangrupikeun pilihan anu saé. pikeun misahkeun gula, asam amino, basa, jeung amida; Kolom siano gaduh selektivitas anu langkung saé nalika misahkeun bahan struktural anu dihidrogenasi sareng teu dihidrogénasi kusabab ayana beungkeut konjugasi. Kolom amino sareng kolom siano sering tiasa dialihkeun antara kolom fase normal sareng kolom fase sabalikna, tapi sering henteu disarankeun. 3.4 Kolom kiral
Kolom kiral, sakumaha nami nunjukkeun, cocog pikeun pamisahan sareng analisa sanyawa kiral, khususna dina widang farmasi. Jenis kolom ieu tiasa dianggap nalika fase sabalikna konvensional sareng kolom fase normal henteu tiasa ngahontal pamisahan isomér. Salaku conto, panulis ngagunakeun kolom kiral 5 μm * 4,6 mm * 250 mm pikeun misahkeun dua isomér 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S) -1, 2-diphenylethylenediamine sareng (1R, 2R) -1, 2 -diphenylethylenediamine, sarta separation antara dua ngahontal ngeunaan 2,0. Sanajan kitu, kolom chiral leuwih mahal batan tipe séjén kolom, biasana 1W + / sapotong. Upami aya kabutuhan pikeun kolom sapertos kitu, unit kedah ngadamel anggaran anu cekap. 3.5 Kolom bursa ion
Kolom bursa ion cocog pikeun misahkeun jeung analisis ion muatan, kayaning ion, protéin, asam nukléat, jeung sababaraha zat gula. Numutkeun jinis pangisi, aranjeunna dibagi kana kolom bursa kation, kolom bursa anion, sareng kolom bursa kation anu kuat.
Kolom bursa kation kaasup kolom dumasar kalsium jeung hidrogén, nu utamana cocog pikeun analisis zat kationik kayaning asam amino. Salaku conto, panulis ngagunakeun kolom dumasar-kalsium nalika nganalisa kalsium glukonat sareng kalsium asétat dina larutan siram. Duanana zat miboga réspon kuat dina λ=210nm, sarta darajat separation ngahontal 3.0; pangarang ngagunakeun kolom basis hidrogén nalika nganalisis zat nu patali jeung glukosa. Sababaraha zat anu aya hubunganana - maltosa, maltotriosa sareng fruktosa - ngagaduhan sensitipitas luhur dina detéktor diferensial, kalayan wates deteksi sakedik 0,5 ppm sareng darajat pamisahan 2,0-2,5.
Kolom bursa anion utamana cocog pikeun analisis zat anionik kayaning asam organik jeung ion halogén; kolom bursa kation kuat boga kapasitas bursa ion luhur tur selectivity, sarta cocog pikeun separation jeung analisis sampel kompléks.
Di luhur ngan ukur bubuka kana jinis sareng rentang aplikasi tina sababaraha kolom kromatografi cair umum digabungkeun sareng pangalaman panulis sorangan. Aya tipe husus kolom kromatografi séjén dina aplikasi nu sabenerna, kayaning kolom kromatografi pori badag, kolom kromatografi pori leutik, kolom kromatografi afinitas, kolom kromatografi multimode, ultra-high kinerja kolom kromatografi cair (UHPLC), kolom kromatografi cairan supercritical ( SFC), jsb Aranjeunna maénkeun peran penting dina widang béda. Jinis khusus kolom kromatografi kedah dipilih dumasar kana struktur sareng pasipatan sampel, syarat pamisahan sareng tujuan anu sanés.
waktos pos: Jun-14-2024